Hücre bozulması ve DNA/RNA ekstraksiyonu için ultrason nasıl kullanılır?

Hücre bozulması ve DNA/RNA ekstraksiyonu için ultrason nasıl kullanılır?

Ultrason, hücre bozulması ve nükleik asit (DNA / RNA) ekstraksiyonunda verimli ve yaygın olarak kullanılan bir teknolojidir.Temel prensibi, hücre yapısını yok etmek ve iç maddeleri serbest bırakmak için kavitasyon etkisi ve mekanik titreşim kullanmaktır.Aşağıda özel mekanizma, başvuru süreci ve temel önlemlerden bir açıklama bulunuyor:

I. Hücre bozulması için ultrasonun prensibi ve işlemi
Hücre bozulmasının özü, hücre zarını (hayvan hücreleri) veya hücre duvarını + hücre zarını (bitkiler, bakteriler, mantarlar vb.) hücre içi maddelerin (nükleik asitler,proteinlerUltrason bu süreci aşağıdaki mekanizmalar yoluyla gerçekleştirir:
1Temel ilke: kavitasyon etkisi
Ultrason, 20kHz'den daha yüksek bir frekansta yüksek frekanslı mekanik bir dalgadır. Ultrasonik sonda (ultrasonik bozanın amplifikatörü) hücreler içeren sıvı numuneye yerleştirildiğinde,Yüksek frekanslı titreşim (genellikle 15-50kHz) üretilirSıvı ortamda kavitasyona neden olan:

Yüksek frekanslı titreşim, sıvıda çok sayıda küçük kabarcık (kavitasyon kabarcıkları) oluşmasına neden olur.Ve sonunda şiddetli bir şekilde patladı..
Bülbüller patladığında, büyük anlık enerji (yerel yüksek sıcaklık, yüksek basınç ve güçlü şok dalgaları) salınacaktır.ve oluşturulan darbe kuvveti hücrenin zar yapısını doğrudan yırtacak (hücre zarı, hücre duvarı) hücre parçalanmasına ulaşmak için.
2Yardımcı etki: mekanik titreşim ve kesme kuvveti
Ultrasonun yüksek frekanslı mekanik titreşimleri hücrelere doğrudan kesme kuvveti ve sürtünme kuvveti de yaratacak, bu da hücre yapısını yok etmeye yardımcı olacak.Özellikle kalın hücre duvarlı hücreler için (babak ve bitki hücreleri gibi).
3Parçalanma süreci (örneğin deneysel işlem)
Tedak edilecek hücre süspansiyonunu (bakteri kültürü sıvısı, doku homogenatı vb.) bir santrifüj tüpüne veya bardağa koyun, ultrasonik sondayı (hornu) yerleştirin,ve sondanın sıvıya daldırılması gerekiyor ama konteyner duvarıyla temas etmiyor..

Ultrasonik cihazı açın ve parametreleri ayarlayın (güç, zaman vb.): Yüksek frekanslı titreşim sıvıda kavitasyon kabarcıkları oluşturur,ve kabarcıkların patlamasından kaynaklanan darbe kuvveti hücre yapısını doğrudan yok eder ve hücre içi maddeleri (nükleik asitler dahil) serbest bırakır., proteinler, metabolitler vb.).
2DNA/RNA ekstraksiyonunda ultrasonun özel uygulanması
DNA / RNA ekstraksiyonunun temel adımları şunları içerir: nükleik asitlerin serbest bırakılması için hücre bozulması → kirliliklerin (proteinler, lipidler, polisakaritler vb.)Ultrasonun rolü esas olarak ilk adımda yoğunlaşır - etkili hücre bozulması ve nükleik asit salınımıÖzel uygulama senaryoları ve avantajları şunlardır:
1Uygun örnek türleri
Ultrason çeşitli örneklerin nükleik asit ekstraksiyonu için uygundur:

Hayvan dokusu (karaciğer, kas gibi): önce küçük parçalara kesilmelidir, ultrason hücreleri hızla bozabilir ve nükleik asit serbest bırakabilir;
Bakteriler/mantarlar: hücre duvarları nispeten sert, geleneksel yöntemler (lizozim tedavisi gibi) verimsizdir ve ultrason güçlü kavitasyon etkisiyle hücre duvarlarını yok edebilir;
Kültürlenmiş hücreler (yapışkan veya süspansiyonlu hücreler): doğrudan süspansiyon ve daha sonra ultrason, karmaşık bir ön tedavi gerekmez;
Bitki dokusu: sellüloz ve pektin içerir, ultrason hücre duvarlarının kırılmasına ve hücre içeriğinin salınmasına yardımcı olabilir.
2İşlemdeki ana parametreler (nükleik asit kalitesini etkileyen)
Ultrasonik işlem, nükleik asit bozulmasını veya aşırı parçalanmayı önlemek için parametrelerin sıkı bir kontrolünü gerektirir (PCR, dizilim vb. gibi sonraki deneyleri etkiler):

 Güç: genellikle 50-300W (örneğin bakterilerin daha fazla güce ihtiyaç duyduğu numune türüne göre ayarlanır).ve çok düşük güç yetersiz parçalanmaya yol açacak.
İş/aralık süresi: Use "pulse" treatment (such as working 30 seconds + intermission 30 seconds) to avoid continuous ultrasonic heat generation leading to nucleic acid denaturation (DNA/RNA is easily degraded at high temperature).
Toplam tedavi süresi: Örneğe bağlıdır (hayvan hücreleri için 1-3 dakika ve bakteriler için 3-5 dakika gibi).
Sıcaklık kontrolü: Süreç boyunca buz banyosu (örnekler buz üzerine yerleştirilir), çünkü ultrasonik işlem ısı üretecektir (yerel yüksek sıcaklıkla birlikte kavitasyon etkisi),Düşük sıcaklık nükleaz aktivitesini inhibe edebilir ve nükleik asit istikrarını koruyabilir.

3Faydaları ve önlemler
Avantajlar
Yüksek verimlilik: Geleneksel yöntemlerden daha hızlı (örneğin öğütme, tekrarlanan dondurma ve çözme, enzimatik hidroliz) (genellikle birkaç dakika içinde tamamlanır) ve daha kapsamlı kesinti;
Unuversalite: Çeşitli numune türlerine (hayvanlar, bitkiler, mikroorganizmalar vb.) uygulanabilir;
Çözümlenmesi kolay: Karmaşık rejanlar gerekmez, sadece ultrasonik aletler ve temel santrifüj ekipmanları gereklidir.
Önlemler
Bülbüllerden kaçının: Eğer numunede çok sayıda baloncuk varsa, kavitasyon etkisinin verimliliği azalır ve sonda aşırı ısınır.Sonda tamamen sıvıya battığından emin olun (sıvı seviyesi yaklaşık 1-2cm);
Nükleaz inhibe edilmesi: Bozulmadan sonra, hücre içi nükleazları (RNA' yı kolayca parçalayan RNase gibi) inhibe etmek için lizis çözeltisi (EDTA, deterjan vb. dahil) zamanında eklenmelidir.
Örnek hacmi: Tek işleme hacmi çok büyük olmamalıdır (genellikle ≤5mL), aksi takdirde ultrasonik enerji dağılımı eşit olmayacak ve bozulma etkisi büyük ölçüde değişecektir.

Özet
Ultrason, kavitasyon etkisi ve mekanik titreşim yoluyla hücreleri verimli bir şekilde bozar ve DNA / RNA ekstraksiyonu için önemli bir "başına çıkış adımı" sağlar.Nükleik asit bütünlüğünün korunmasını en üst düzeye çıkarırken hücrelerin tamamen bozulması için zaman ve sıcaklıkBu teknoloji, moleküler biyoloji deneylerinin (gen klonlama, qPCR, transkriptom analizi vb.) işlem öncesi aşamasında yaygın olarak kullanılır.) ve nükleik asit ekstraksiyonu için önemli bir araçtır..